DFG-Forschergruppe 1220
"Prosthetic Groups: Transport and Insertion"
(PROTRAIN)
Summary:
Enzymatic reactions are the driving force of metabolism. Complex cofactors and prosthetic groups of the enzymes involved allow the catalysis of challenging chemical reactions. While the biosynthesis of many prosthetic group is well understood, their transport and regulated insertion into target enzymes is mainly unknown. Based on our long standing background in biosynthesis und functionality of prosthetic groups, we focus in Braunschweig with eight projects on the investigation of the unknown molecular strategies for transport and insertion of molybdenum cofactors (Moco) and hemes into enzymes. In close cooperation, a broad spectrum of methods will be employed ranging from genetic, biochemical and structural approaches to chemical synthesis and bioinformatics tools. The common major scientific goal of this Research Group is (1) the investigation of the complete path for ready synthesized Moco and heme through a cell, and (2) the elucidation of the various mechanisms of insertion of these prosthetic groups into their corresponding target enzymes. We envisage the deduction of novel fundamental principles that will allow to understand and predict these processes at the molecular level both in bacterial and eukaryotic systems.
Sprecher: Prof. Dr. Ralf R. Mendel
Institut für Pflanzenbiologie der TU Braunschweig
Tel: 0531 - 391 5870
r.mendel@tu-bs.de
TP1: "Role of Moco-binding proteins for the insertion of molybdenum cofactor into apo-enzymes"
Prof. Dr. Ralf R. Mendel
Institut für Pflanzenbiologie der TU Braunschweig
r.mendel@tu-bs.de
Es ist derzeit ungeklärt, wie der Molybdäncofaktor (Moco) nach der Biosynthese auf seine Nutzer Apo-Enzyme verteilt wird. Eine strukturbasierte Homologiesuche führte in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zur Identifizierung von 9 putativen Moco-Bindeproteinen (bezeichnet mit LDP), die eine Funktion zu haben scheinen bei der Freisetzung des Moco vom Ort seiner Biosynthese, bei der Stabilisierung des Cofaktors und auch bei der Insertion des Moco in seine Zielenzyme. Diese Funktionen sind neuartig, bisher weder bei Eukaryonten noch bei Prokaryonten beschrieben worden, und wir wollen diese Funktionen im Detail zu untersuchen. Wir haben folgende Ziele im Einzelnen: (1) Aufklärung des molekularen Mechanismus, mit dem die LDP Proteine die Freisetzung des Moco aus seinem Biosynthesekomplex heraus initiieren, (2) Untersuchung de Mechanismus, mit dem die LDP Proteine die Stabilisierung des Moco bewirken und die Insertion in Zielproteine bewerkstelligen (was ist das Timing dieses Prozesses?). (3) Wir wollen die humanen LDP-Homologen identifizieren und charakterisieren. (4) Wir wissen, daß die Interaktion zwischen LDPs und Moco-Donor/Akzeptor-Proteinen nur schwach ist; deshalb wollen wir methodische Ansätze verbessern, die es möglichen, diese Art von transienten Interaktionen zu detektieren. Schließlich wollen wir testen, ob LDPs auch die Freisetzung/Stabilisierung/Inser-tion von anderen prosthetischen Gruppen wie Häm, FeS und FAD fördern.
TP2: "Mechanism of insertion of prosthetic groups into complex molybdo-enzymes (molybdo-iron-flavo enzymes)"
Dr. Florian Bittner
Institut für Pflanzenbiologie der TU Braunschweig
f.bittner@tu-bs.de
Komplexe Molybdo-Enzyme (Mo-Enzyme) der Xanthinoxidase-Familie wie Xanthindehydrogenase (XDH) und Aldehydoxidase (AO) sind aus zwei identischen Untereinheiten zusammengesetzt, wobei jede einzelne einen Molybdäncofaktor (Moco), ein Flavinadenindinukleotid (FAD) und zwei Eisen-Schwefel-Cluster vom [2Fe-2S]-Typ bindet. Aufgrund der Diversität ihrer verschiedenen prosthetischen Gruppen stellen AO und XDH besonders geeignete Modell-Proteine für die Untersuchung der sequentiellen Insertion solcher Gruppen während der Reifung von Proteinen dar. Es ist daher ein Ziel dieses Projektes, die Reihenfolge der Insertion von prosthetischen Gruppen zu identifizieren sowie zu zeigen, ob die Insertion einer bestimmten Gruppe die Voraussetzung für die Insertion der nächsten ist. Hierfür soll unter Nutzung der Apo-Proteine von AO und XDH ein vollkommen definiertes in vitro-System für die Insertion jeder prosthetischen Gruppe, insbesondere FAD und Moco, etabliert werden. Da die Insertion in vivo sehr wahrscheinlich von spezifischen Proteinen unterstützt wird, sollen diese Proteine, die als Chaperone fungieren könnten, identifiziert werden. Als eine gemeinsame besondere Eigenschaft benötigen AO und XDH zusätzlich eine post-translationale Sulfurierung ihres Moco zur Aktivierung, welche durch die Moco-Sulfurase ABA3 katalysiert wird. Bisherige Ergebnisse deuten an, dass hierzu nicht nur ein Schwefel-Atom von ABA3 auf den Moco von AO und XDH übertragen wird, sondern dass wahrscheinlich der gesamte desulfo-Moco von AO und XDH gegen einen von ABA3 bereitgestellten sulfurierten Moco ausgetauscht wird. Unterstützt durch die bekannten Interaktionen zwischen ABA3 und seinen Zielproteinen strebt dieses Projekt daher auch die Co-Kristallisierung von ABA3 mit XDH an.
TP3: "Insertion of sulfurated molybdenum cofactor into target enzymes: structural analysis of the activation complex"
Prof. Dirk Heinz
Abt. Strukturbiologie
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig
dirk.heinz@helmholtz-hzi.de
Der Molybdän-cofaktor (Moco) ist tief im Inneren von Mo-Enzymen verborgen. Moco enthaltende Enzyme, welche der Xanthinoxidase-Klasse zugeordnet werden, werden posttranslational über eine Sulfurierung ihres Mo-Zentrums modifiziert. Diese Modifikation wird von der Mocosulfurase ABA3 (in der Pflanze Arabidopsis thaliana) katalysiert. Ziel dieses Projektes ist die Entschlüsselung des Reaktionsmechanismus' dieser neuartigen posttranslationalen Modifikation über die Röntgenstrukturaufklärung des Proteinkomplexes zwischen ABA3 und seinem Zielenzym Xanthindehydrogenase. Von besonderem Interesse ist der Mechanismus, über welchen sich die C-terminale Domäne von ABA3 (ABA3-CT) Zugang zum Mo-Zentrum des Zielenzyms verschafft. Die Aminosäuresequenz von ABA3-CT zeigt keinerlei Gemeinsamkeiten zu bekannten Sequenzen. Die Aufklärung der Struktur von ABA3-CT im Komplex mit der Xanthindehydrogenase wird deshalb (i) einen signifikanten Beitrag zum Verständnis der Moco-Bindung an ABA3-CT leisten, (ii) den Mechanismus aufklären, wie ABA3-CT die Sulfurierung des Mo-Zentrums in Xanthindehydrogenase katalysiert, (iii) möglicherweise die Struktur eines Proteins mit einem bisher nicht bekannten Faltungstyp beschreiben, sowie (iv) die molekularen Grundlagen für eine humane Erbkrankheit schaffen.
TP 4: “Incorporation of the prosthetic heme group into cytoplasmatic and membrane proteins”
Prof. Dieter Jahn
Institut für Mikrobiologie der TU Braunschweig
d.jahn@tu-bs.de
Hämproteine, wie verschiedene Enzyme, Sensoren und Elektronen transportierende Cytochrome sind essentielle und entsprechend gut charakterisierte Bestandteile fast aller Organismen der Erde. Dem entsprechend ist der Weg zur Biosynthese der Häme gut verstanden. Im Gegensatz dazu steht die Unkenntnis über die Schritte zwischen Hämbiosynthese und Hämproteinfunktion, nämlich die des Hämtransportes und des Hämeinbaus in Proteine. Deshalb wollen wir in diesem Projekt genau diese Kenntnislücke schließen und die cytoplasmatischen und Membran lokalisierten Proteine für den Transport und Einbau von Häm identifizieren. Dazu haben wir vier verschiedene experimentelle Ansätze gewählt. Ein bereits erfolgreich im Labor genutzter Pseudomonas aeruginosa Two Hybrid Screen mit dem letzten Enzym der Hämbiosynthese Ferrochelatase, dem Hämenzym Katalase und dem Eisen und Häm speichernden Protein Bacterioferritin als bait soll zur Identifizierung von Bindungspartnern dienen. Ein biochemischer Ansatz nutzt die Bindung von Proteinen aus zellfreien Extrakten von Escherichia coli, Bacillus subtilis und P. aeruginosa an Säulenmaterial immobilisiertes Häm und seine Derivate, sowie an über Tags immobilisierte, zuvor gelistete Proteine zum gleichen Zweck. Ein genetischer Screen nach Häm transportierenden und integrierenden Proteinen nutzt die blaue Farbe, die durch die Umwandlung von Tryptophan durch heterolog in E. coli produzierte Häm-abhängige Dioxygenasen entsteht. Schließlich soll die mögliche Funktion von Bacterioferritin als Hämtransporter und Einbauprotein experimentell geklärt werden. Identifizierte Proteine sollen gründlich biochemisch auf Protein-Protein-Wechselwirkungen, Kinetik des Hämtransfers und Einbaus mit breiter Methodik in vivo und in vitro analysiert werden. Strukturelle Grundlagen werden mittels Proteinkristallographie untersucht.
TP5: “Insertion of tetrapyrrole cofactors into cytochrome cd1 nitrite reductase”
Dr. Gunhild Layer
Institut für Mikrobiologie der TU Braunschweig
g.layer@tu-bs.de
Ziel dieses Projektes ist die Untersuchung des Einbaus der Tetrapyrrol-Kofaktoren in die Cytochrom cd1 Nitritreduktase (NirS). NirS katalysiert während der anaeroben Nitratatmung die Reduktion von Nitrit zu NO. Das Enzym enthält ein kovalent gebundenes Häm c und ein nicht kovalent gebundenes Häm d1. Die kovalente Verknüpfung von Häm c an Proteine wird von den Proteinen des so genannten Ccm Systems vorgenommen. Über den Einbau des Häm d1 in NirS ist dagegen nichts bekannt. Ein möglicher Kandidat, der am Häm d1 Einbau beteiligt sein könnte, ist das Protein NirN. Die Aminosäuresequenz von periplasmatischem NirN zeigt 24 % Identität zur NirS Sequenz, inklusive einer Homologie in der Häm d1 Bindungstasche. NirN besitzt keine Nitritreduktase Aktivität. Daher könnte NirN als ein Häm d1 Chaperon bzw. Transportprotein dienen, welches den Kofaktor zu NirS transportiert. Die Ziele dieses Projektes sind die Untersuchung der Bindung von Häm d1 an NirN in vitro und des Transfers des Kofaktors von NirN auf NirS. Die für den Kofaktortransfer nötigen Protein-Protein Wechselwirkungen zwischen NirN und NirS werden untersucht werden. Mutagenesestudien sowie Proteinkristallisation und Strukturaufklärung werden Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehung von NirN gewähren und Vergleiche mit NirS ermöglichen. Schließlich sollen weitere, bisher noch unbekannte Proteine, die am Häm d1 Transport und Einbau beteiligt sind, identifiziert werden. Im Rahmen dieser Forschergruppe dient der Kofaktoreinbau in die Nitritreduktase als ein Modellsystem für periplasmatische Proteinreifung.
TP6: “Photoaffinity labeling of heme proteins with chemically modified prosthetic groups”
Prof. Thomas Lindel
Institut für Organische Chemie der TU Braunschweig
th.lindel@tu-bs.de
Die Ziele der Forschergruppe PROTRAIN umfassen das Verständnis der Insertion prosthetischer Gruppen in Apoproteine auf atomarer Ebene und die Suche nach Proteinen, die am Transport von Häm beteiligt sind. In beiden Fällen sind Häm-Derivate als molekulare Werkzeuge zu entwickeln, die kovalent an Zielproteine binden. Unser Projekt wird Photoaffinitätsmarkierung und Fourier-Transform-Massenspektrometrie kombinieren. Durch chemische Synthese sollen Diazirin-funktionalisierte Häme ausgehend von leicht verfügbarem Hämin erhalten werden. Bei UV-Bestrahlung werden chemisch reaktive Carbene generiert, die bei Rekonstitutionsexperimenten Apoproteine funktionalisieren und die Addukte für die Untersuchung durch höchstauflösende Orbitrap-Massenspektrometrie zugänglich machen. Wenn mit Substanzmengen im Milligramm-Bereich gearbeitet wird, wird die Analyse von Peptid-Fragmenten auch durch 600-MHz-NMR-Spektroskopie möglich, resultierend in detaillierter Strukturinformation. Es ist geplant, den Prozess der Insertion soweit zu verlangsamen, bis Punkte entlang des Insertionsweges nachweisbar werden. Parallel wird unser Syntheseprogramm immobilisierte Sonden und chemisch modifizierte Quervernetzer in Kooperationen mit den Gruppen Jahn, Layer und Mendel einbringen.